Tetrahymena pyriformis szaporodás-gátlási teszt vízmintákhoz (felszíni és felszín alatti víz, csurgalék víz és szennyvíz)

A Tetrahymena pyriformis, eukarióta, vízben élő állati egysejtű (protozoa). A protozoák országán belül, a legfejlettebb fajokat magában foglaló csillós egysejtűek törzsébe (Ciliopora) tartozik. A Tetrahymena pyriformis mérete körülbelül 25–90 μm, nevét körtére emlékeztető alakjáról, illetve a sejtszáj négy mozgó, hártyaszerű képletéről kapta. Külső felületén sűrű, hajszerű bevonatot, képeznek a csillók, melyeknek koordinált mozgását primitív idegrendszer irányítja. Kutatások kedvelt tesztorganizmusa, a könnyű fenntarthatósága, gyors szaporodása miatt, de főként azért, mert sejtje sokban hasonlít a nála jóval fejlettebb gerincesek sejtjeihez.

Az állatok számának (sejtszám) változását nyomon követve a vegyi anyagok és környezeti minták (talaj, üledék, felszíni és felszín alatti víz, továbbá szennyvíz) toxikus hatása vizsgálható. A tesztmódszer Gruiz és Leitgib (2006) fejlesztették ki, később a módszer a BME ABÉT tanszéken továbbfejlesztésre került.

A teszt kivitelezése

Tápoldat (PP): 10g tripton, 1g élesztőkivonat, 1000 cm³ csapvíz, sterilezés autoklávban 121 °C-on 20 percig.

Inokulumkészítés: A tesztállatot hetenkénti átoltással tartjuk fenn. 100 μl sejtszuszpenziót oltunk át 5 ml steril PP tápoldatba, majd 20 °C-on, sötétben termosztáljuk.

A vizsgálat menete:

A teszt során a felszíni vízmintából, ill. megfelelő hígításaiból 15–15 ml-t 100 ml-es steril Erlenmeyer lombikba mérünk és 15 ml PP tápoldatot, valamint 156 μl antibiotikum oldatot (0,2% Penicillin, 2% Streptomycin, 1% Nystatin) adunk minden lombikhoz, majd 600 μl 6 napos homogén Tetrahymena tenyészettel oltjuk be. Három párhuzamost alkalmaztunk. A vegyi anyagból hígítási sort készítünk. Kontrollként steril csapvizet alkalmazhatunk. A lombikokat 100 rpm fordulatszámon, szobahőmérsékleten (20-25 °C-on), sötétben rázatjuk.

A mérés kiértékelése:

72 óra alatt négy mérésből fel lehet venni az egysejtű jellegzetes szaporodási görbéjét. A sejtszámlálásnál a sejtszuszpenziót homogenizáljuk (óvatosan felkeverjük), majd 500 μl-t veszünk ki belőle, melyhez 20 μl 1%-os formalin oldatot adunk, majd ismét óvatosan elkeverjük. A sejtszámot mikroszkópos sejtszámlálással határozzuk meg: Bürker-kamrára cseppentve megszámoljuk 2 μl sejtszuszpenzióban lévő sejtek számát. Szükség esetén a szuszpenziót vízzel hígítjuk. A szaporodási görbe exponenciális szakaszára illesztett görbe meredekségét hasonlítjuk össze a szennyezetlen kontrolléval.