PCR működése

A PCR-eljárás húsz-harminc ciklus egymásutánjából áll. Mindegyik ciklus három lépést tartalmaz.

i.: A kettős szálú DNS-t 94-96 °C-ra hevítik, hogy a szálak szétváljanak. Ebben a denaturálásnak hívott lépésben a két DNS-szálat összekötő hidrogénkötések felbomlanak. Az első ciklus előtt a DNS-t gyakran hosszabb ideig denaturálják, hogy a templát DNS és a primerek kettős szálai is teljesen szeparálódjanak. Idő: 1-2 perc.

ii.: A DNS-szálak szeparálása után a hőmérsékletet csökkentik, úgyhogy a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálakhoz. Ezt a lépést annealing vagy kapcsolódási lépésnek nevezik. A hőmérséklet ebben a fázisban függ a primerektől, és általában 5 °C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt (45-60 °C). Ha a kapcsolódási lépésben a hőmérséklet nem megfelelő, a primerek vagy egyáltalán nem kötődnek a templáthoz, vagy véletlenszerűen kötődnek. Idő: 1-2 perc.

iii.: Végül a DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat. A munkát a kapcsolódott primernél kezdi, és végigmegy a DNS-szálon. A lépés neve meghosszabbítás, ami szintetizálás alatt álló nukleinsavszál meghosszabbítására utal. A szintetizálás során a szülő nukleinsavszál szolgál templátként a leány lánc szintetizálásához. A meghosszabbítás hőmérséklete a DNS-polimeráztól függ. A lépés időigénye egyrészt függ magától a DNS-polimeráztól, másrészt az amplifikálandó DNS-szakasz hosszától. Ökölszabályként a percenként 1000 bázispár sebesség alkalmazható.