Western blot

A Western-blot egy olyan molekuláris biológiai/biokémiai módszer, melyet fehérjék azonosítására használnak. Ezt a fehérje-analitikai módszert azért tárgyaljuk itt a DNS-technikák között, mert mind kivitelezésében, mind alkalmazását tekintve szorosan kötődik a modern géntechnikákhoz, a rekombináns fehérjék előállításához.

A Western-blothoz specifikus antitesteket használnak. A Western-blot egy olyan analitikai technika, amelyet sejt/szövet fehérje expressziójának követésére, a fehérje-termelés mérésére, minőségi ellenőrzésre, orvosi diagnosztikára, illetve kutatási eszközként hoztak létre. Az elnevezés a DNS-re kidolgozott Southern blot elnevezéséből ered, melyet már korábban kifejlesztett Edwin Southern. Ez után keresztelték el az RNS-t kimutató módszert Northern blotnak, és a fehérje-analizálót ironikusan Western blotnak.

A blottolás tulajdonképpen azt jelenti, hogy egy háromdimenziós gélből egy kétdimenziós membránfelületre visszük át a gélen elválasztott frakciókat, azért, hogy a speciális membránhoz kötve egyszerű technikákkal tudjuk kezelni, reagáltatni, mosni, mérőműszerbe behelyezni a vizsgálandó minta frakcióit.

A Western blot analízis kivitelezése:

Gél elektroforézissel a minta fehérjéit a gélen moláris tömegük alapján választják el.  Mivel az elektroforézis gél vékony és törékeny, ezért nehéz lenne véghezvinni a fehérjék kimutatásához szükséges minden lépést rajta. Emiatt transzferálják nitrocellulóz membránra a gél tartalmát. Ez maga a blottolás folyamata, amikor a fehérjék a membránra kerülnek át. A membránnak fehérje kötő részei vannak, melyek nem specifikusak, minden fehérjét azonos valószínűséggel kötnek. A kötés pedig hidrofób kölcsönhatás alapján megy végbe, illetve elektromos hatások is fellépnek a membrán és a fehérje között. Ezután a membránt blokkolják, hogy megakadályozzák a nem-specifikus fehérje kölcsönhatásokat a membrán és az antitest fehérjék között. Ezt úgy oldják meg, hogy a membrán tszérum albumin; nem zsíros, száraz tejpor és detergensek (mint a Tween 20, vagy a kolloidális szén) oldatába helyezik. Blokkolás nélkül az antitestek a membránhoz is kötődnének. A megjelöléshez olyan antitestre van szükség, amely felismeri a vizsgálandó fehérjét és tartalmaz detektálható címkét. A primer antitestet inkubálják a membránnal, ezután néhány mosási eljárás után detektálunk.