Colpoda steinii

Tesztorganizmus neve

Latin név

Colpoda steinii

Rendszertani besorolás [1]

Ország

Protozoa

Törzs

Ciliophora

Osztály

Ciliatea

Rend

Entodiniomorphida

Család

Colpodidae

Nem

Colpoda

Faj

Colpoda steinii

Tesztorganizmus jellemzői

Élőhely

talaj [2]

Fontosabb külső jegyek

Átlagos mérete: 20-40 x 15-30 mikron. [3] Csillós, és mivel protozoa, ezért nem rendelkezik sejtfallal. [2]

Táplálkozás

Vizes közegben táplálkoznak így a vizes közegű tesztoldatokban lévő toxikus anyag a táplálékkel együtt kerül be a sejtjébe. [2]

Szaporodás

Rendszerint osztódással szaporodik. A cisztából kb. 4-8 egyed fejlődik ki. [4]

Egyéb fontosabb jellemzők

Széles körben elterjedt kis- és közepes méretű faj, általában szabadon élő, de szárazföldi csigák parazitáiként is megfigyelhető. [5]

Szabványok és referenciák [2]

Szabványosított tesztmódszer?

nem

Nem szabványos tesztmódszerek

Colpoda steinii növekedésgátlási vizsgálata (talajra adaptált és direkt kontaktra kidolgozott változat: BME-MGKT)

Környezettoxikológiai alkalmazás

Tesztorganizmus fenntartása

A Colpoda steinii szaporítása egy növekedésben lévő Pseudomonas fluorescens baktériumtenyészeten történik. A Pseudomonas fluorescens tenyészetet 25 °C-on 48 órán át szaporítjuk "E" tápoldatban (a). A Colpoda steinii szaporítása az (a) tápoldatban történik, 25 °C-on 48 órán át (b).

"E" tápoldat:

• NaCl 0,1g
• K2HPO4*3H2O 1,36g
• KH2PO4 0,75g
• CaCl2*2H2O 0,033g
• (NH4)2SO4 0,25g
• MgSO4*7H2O 0,2g
• Mikroelem oldat 3 ml
• Élesztőkivonat 1g
• Glükóz 1g
• Ioncserélt víz 1000ml

Mikroelem oldat:

• EDTA 5g
• ZnSO4*7H2O 2,2g
• MnSO4*4H2O 0,57g
• FeSO4*7H2O 0,5g
• CoCl2*6H2O 0,161g
• CuSO4*5H2O 0,157
• Na2MoO4*2H2O 0,15g
• Ioncserélt víz 1000ml
• Állítsuk be a pH-t 6-ra 40 %-os KOH -val.

[2]

Teszteléshez használt organizmus jellemzői

A Pseudomonas fluorescens-t 1:10 hígítású NB tápoldatban 25 °C-on 24 órán át levegőztetve szaporítjuk (c). A Colpoda steinii-t 25 °C-on 24 órán át tenyésztjük (c)-ben, levegőztetés mellett (d). Párhuzamosan a Pseudomonas fluorescens-t 50 ml NB-ben 25 °C-on 24 órán át szaporítjuk (e).

NB tápoldat (Nutrient Broth):

• "Lab Lemco" por 1g
• Pepton 5g
• Élesztő kivonat 2g
• NaCl 5g
• Ioncserélt víz 1000ml

[2]

Tesztorganizmus érzékenysége

nehézfémek [6]

Tesztmódszer alkalmassága

pórusvíz, talajkivonat, talaj szuszpenzió [2], talaj [6]

Tesztelés elve

Akut toxicitási teszt. A tesztorganizmusunk szaporodását befolyásolja a mintánk tartalma, és ebből következtethetünk a minta toxikus hatásaira.

Tesztmódszer leírása

A vizsgálat menete:

Az (e) tenyészet sejtjeit centrifugáljuk 3600 rpm-en 10 percig, 50 ml-es centrifugacsöveket használva. A sejteket kétszer mossuk P+J oldattal és 10 ml-el szuszpendáljuk fel. A P+J oldat tejszerűvé teszi a sejtszuszpenziót (f).

P+J oldat:

• Az „A”, a „B” és a „C” oldatok mindegyikéből 1-1 ml-t 997 ml ioncserélt vízzel 1000 ml-re egészítünk ki.
• „A” oldat: CaCl2*2H2O 0,433g; KCl 0,162g
• „B” oldat: K2HPO4*3H2O 0,648g
• „C” oldat: MgSO4*7H2O 0,28g

A teszteléshez használandó Colpoda sejtek denzitásának ellenőzése a (d) szuszpenzióban történik. A (d)-ből kivett, ismert mennyiségű sejtszuszpenziót Lugol-oldattal rögzítjük (1 csepp ml-enként), megfestjük malachitzölddel (1 csepp ml-enként) és végül mikroszkóp alatt Bürker kamrában megszámláljuk a Colpoda sejteket.

Malachitzöld oldat:

• 1 %-os malachitzöld vizes oldat
• Lugol oldat
• 5 %-os jód és 10 %-os kálium – jodát

A mérés kivitelezése:

A tesztcsövekbe mérünk:

• 50 ml Pseudomonas szuszpenziót (f)
• 50 ml Colpoda szuszpenziót (d)
• 900 ml tesztelendő vagy kontroll mintát

Inkubálás: a kémcsöveket 25 °C-on 24 órán át tartjuk az inkubátorszobában vagy termosztátban. Ahhoz, hogy elkerüljük a minták benedvesedését vagy befertőződését steril, fedhető kémcsöveket alkalmazunk.

Rögzítés és számlálás, a mérés kiértékelése:

24 óra után 1 csepp Lugol oldatot és 1 csepp malachitzöld oldatot adunk minden egyes mintához. A mintákat Bürker kamrában számláljuk. A pipettázás előtt a mintákat jól felrázzuk, a számlálókamrát pedig fedőlemezzel fedjük le és mikroszkóp alatt számláljuk a sejteket. A Colpoda steinii a toxikus anyag hatására inaktívvá válhat és sejtcsoportosulást hozhat létre. Ez megnehezíti a mikroszkóp alatt történő számlálást.

Számlálás részecskeszámlálóval:

A sejtek számának megállapítására elektronikus sejtszámlálót is lehet alkalmazni. LABORSCALE (PSL-1) - ANALISATOR (PSA-1) részecskeszám- és részecskenagyság elemző készülékkel (Medicor Művek) végezhetjük a mérést. A Colpoda steinii inaktív formában hajlamos összecsapódni, a sejtcsoportosulás megszüntetésére ultrahangos dezintegrátoros kezelést alkalmazunk 10 másodpercig. A sejtszámláláshoz használt mérőkapilláris: 200 mm. A mérőáram 400 mA. Minimum három párhuzamos mérést kell végezni. Akkor kezdhetjük a mérést, amikor a háttér 0 értéket mutat.
[2]

Mérési végpontok

élő tesztorganizmusok száma [2]

Méréshez szükséges műszerek

mikroszkóp vagy elektromos részecskeszámláló [2]

Tesztek időigénye

48 óra [2]

Egyéb

Megjegyzések

Az állati egysejtűekkel való munka viszonylag egyszerű és gyors, az eredmény a környezeti kockázatfelmérésben igen fontos trofikus szintet (állat) képvisel. [2]